Bakterier odlas i petriskålar på ett fast medium som kallas bakterieagar, där upphöjda, cirkulära kolonier bildas. Till skillnad från en enskild bakteriecell är en koloni en grupp bakterier som är tillräckligt stora för att vara synliga för blotta ögat. Bakterietillväxt kan mätas genom enkel observation av hur många kolonier som finns; mer kvantitativa metoder inkluderar emellertid användningen av en räknekammare, eller oftare, livskraftiga plåträkningar.
Den sistnämnda används mest då den också ger kvalitativ information såsom effekten av varierande tillväxtförhållanden. Eftersom det kan finnas miljarder bakterier i en petriskål, kräver mätning först utspädning av provet så att det är möjligt att räkna antalet kolonier.
I ett provrör, tillsätt 10 mikroliter av startmedlet bakteriekultur till 90 mikroliter spädningsmedium. Stäng locket på röret ordentligt och vortexa försiktigt för att få en homogen blandning. Nu är provet en tiondel av sin ursprungliga koncentration.
Överför 10 mikroliter av denna nya provet till ett nytt provrör som innehåller 90 mikroliter spädningsmedium, blanda det igen. Återigen kommer resultatet att bli provet ytterligare utspätt – nu kommer det att vara en hundradel av sin ursprungliga koncentration. Upprepa detta flera gånger tills originalprovet har spätts ut mellan 104 och 1010 gånger. Se till att varje rör är märkt med rätt utspädning, till exempel 10-1, 10-2 och så vidare.
Fördela 10 mikroliter av den sista utspädningen på agarplattan. Använd spridningskanten och fördela bakterielösningen över hela ytan av agarplattan. Upprepa detta för ytterligare två tallrikar. Det är också vanligt att utföra dessa steg med andra utspädningsnivåer för jämförelse. Se till att märka plattornas botten. Sätt tillbaka locken på varje platta och låt agarplattorna torka i flera minuter antingen på en laboratoriebänk under en låga eller i en inkubator. Placera plattorna i inkubatorn som ska ställas in på lämplig temperatur för bakteriestammen. Låt växa i 12 till 16 timmar.
Kolonier bör vara synlig efter 16 timmar; dock kan vissa genetiska modifieringar kräva längre tid (till exempel färgutveckling). När kolonier är observerbara, ta ut plattorna och hitta de som har mellan 30 och 300 kolonier. Använd en permanent markör och placera en prick på botten av petriskålen – sidan med agaren, inte locket – varhelst en koloni är synlig genom agaren. Räkna varje markörprick. Upprepa för varje maträtt.
För att mäta mängden av bakterier i startkulturen för detta experiment, måste spädningen vändas i beräkningarna, på två ställen. För det första, när du tog en mikroliter från provröret för att lägga i petriskålen, tog du en tiondel av det utspädda provet, så du måste multiplicera allt med 10 för att vända det.
Dessutom, om utspädningsfaktorn i provröret var t.ex. 10-7, då talet kolonier måste multipliceras med 107 för att vända utspädningseffekten. Ta helt enkelt bort det negativa tecknet från exponenten i beräkningarna. Använd formeln: × 10 × [hur många gånger provet måste multipliceras för att komma till den ursprungliga koncentrationen: till exempel, 105] = Antal kolonibildande enheter (CFU) per milliliter startkultur. Detta är bakterietillväxten i dina petriskålar.
Saker du behöver
- Utspädning media
- Pipetter och tips
- Rör
- Bakterieodlingsmedier och agarplattor
- Virvel
- Bunsenbrännare
- Glasspridare
- 70 procent etanol
Tips
Se till att sterilisera glasspridaren genom att doppa spridarkanten i 70 procent etanol och föra in den i en bunsenbrännarlåga. Låt etanolen fatta eld och bränn långsamt bort alkoholen, vilket kommer att döda all bakteriell kontaminering. Rör försiktigt vid den torra (det vill säga inga bakterier) delen av agaren för att kyla den – agarn ska inte smälta vid kontakt.
