I kemiska reaktioner som katalyseras av ett enzym, sänker enzymet mängden aktiveringsenergi som krävs genom att tillfälligt binda till substratet och vrida det till ett ansträngt tillstånd. k(katalysatorn) eller ”kcat” för reaktionen hänvisar till den koncentrationsoberoende konstanten för den hastighet med vilken ett visst enzym kan metabolisera ett substrat till en produktmolekyl. För att beräkna kcat blandar forskare först flera provrör med varierande koncentrationer av substrat (känd som en ”enzymatisk analys”) och testar dem med konstanta tidsintervall med en ljusspektrofotometer för att mäta de växande koncentrationerna av produktmolekyler. Dessa data plottas sedan på en graf och analyseras.
Beräkna initiala hastigheter
Rita ett diagram över produktkoncentration kontra tid för data från den enzymatiska analysens första provrör. Obs: den horisontella axeln ska vara ”tid” och den vertikala axeln ska vara ”produktkoncentration.”
Beräkna den linjära regressionslinjen för datapunkterna du plottade i avsnitt 1, steg 1. Även om Excel och grafräknare enkelt kan bestämma denna linjära modell, kan du härleda en uppskattning av regressionslinjens lutning genom att dividera skillnaden i produktkoncentration mellan angränsande datapunkter med deras skillnad i tid.
Anteckna lutningen för den linjära regressionslinjen från avsnitt 1, steg 2 som ”initial reaktionshastighet (Vo).” Obs: i regressionslinjemodellen ” = m [time] + b,” koefficienten ”m” är lutningen.
Upprepa steg 1, 2 och 3 för resten av provrören i analysen.
Beräknar Vmax
Rita inversen av substratkoncentrationen för varje provrör kontra inversen av dess initiala reaktionshastighet (från avsnitt 1, steg 4). Till exempel, om initialhastigheten för ett provrör med en initial substratkoncentration på 50 mikromolar (uM) var 80 uM/s, inverserna skulle vara 1/50 uM för substratkoncentrationen och 1/80 uM/s för den initiala hastigheten. Notera: den omvända substratkoncentrationen bör vara på den horisontella axeln, och invers initial hastighet bör vara på den vertikala axeln.
Obs: substratkoncentrationen ska vara på den horisontella axeln, och initial reaktionshastighet ska vara på den vertikala axeln.
Bestäm den linjära regressionslinjen för diagrammet du ritade i avsnitt 2, steg 1. Notera: eftersom du behöver känna till y-skärningspunkten för regressionslinjen bör du ange punkterna från avsnitt 2, steg 1 i antingen Excel eller en grafräknare och använda den inbyggda regressionsmodelleringsfunktionen.
Dividera 1 med y-skärningen från den linjära regressionslinjen. Detta kommer att ge dig värdet på inversen av Vmax, den maximala reaktionshastigheten för enzymet. Notera: om den linjära regressionsmodellen har formen ”[Inverse Vo] = m [Inverse Substrate Conc.] + b”, så skulle värdet på ”b” vara y-korsningen. Dividera 1 med ”b” för att beräkna inversen av Vmax.
Dividera 1 med resultatet från avsnitt 2, steg 3 för att beräkna det faktiska värdet på Vmax.
Bestäm koncentrationen av enzymet i originalet analys (se rådata). Obs: enzymkoncentrationen är densamma för alla provrören; endast substratkoncentrationerna varierar i analysen.
Dela Vmax (från avsnitt 2, steg 4) med enzymkoncentrationen (från avsnitt 2, steg 5). Resultatet är värdet av Kcat.
